EndoFree Plasmid Maxi Kit 無內毒素質粒大量提取試劑盒

產品信息

產品名稱 產品編號 規格

EndoFree Plasmid Maxi Kit 無內毒素質粒大量提取試劑盒 HRN0031 10 次

產品描述

本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞 ，粗提物通過采用高效的去內毒素系統除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。每次可處理 100-200 ml 細菌培養液 ，理論上最多可提取 2mg 質粒 DNA

產品組分

試 劑 盒 組 成 保存 10 次

RNaseA（ 10mg/mL） 4℃ 1mL

Buffer I 4℃ 120mL

Buffer II 室溫 120mL

Buffer III 室溫 120 mL

Buffer PI 室溫 100mL

Buffer ER 室溫 30mL

Buffer PB 室溫 120mL

Buffer PW 室溫 72mL

第一次使用前請加入 168mL 無水乙醇

Buffer PE 室溫 50mL

Buffer TE 室溫 30mL

針筒內毒素過濾器 室溫 10 個

吸附柱和離心管（ 50mL） 室溫 10 個

產品特點

1.離心吸附柱內硅基質膜全部采用高品質特制吸附膜 ，柱與柱之間吸附量差異極小 ，可重復性好。

2.不需要使用有毒的苯酚 ，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速 ， 方便，從 100-200 mL 大腸桿菌 LB((Luria-Bertani)培養液中，可快速提取 0.5-2mg 純凈的高拷貝質粒 DNA，提取率達 80-90 %。

3.本試劑盒提取的質粒 DNA ， 內毒素含量極低（ <0.1 EU/ μg DNA） ，細胞轉染效果佳。也可直接用于酶切、轉化、 PCR、體外轉錄、測序、等各種分子生物學實驗。

運輸和保存方法

1）本試劑盒在室溫儲存 12 個月不影響使用效果。

2）第一次使用時，將試劑盒所帶全部的 RNase A 加入 Buffer I 后（終濃度 100ug/mL）置于 4℃保存。如果 Buffer I 中 RNase A 失活 ，提取的質粒可能會混雜有微量 RNA 殘留 ，在 Buffer I中補加 RNase A 即可。(使用前，用多少取多少，放置27°C孵化5~10min)

3）環境溫度低時 Buffer II 中 SDS 可能會析出出現渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清 ，不要劇烈搖晃 ，以免形成過量的泡沫。

4）避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、 pH 值變化 ，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

注意事項

1.所有的離心步驟如未加另外說明均在室溫完成，使用轉速可以達到 12,000 x g，帶 50 mL 轉頭的臺式離心機。

2.提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于 10kb的大質粒 ，應加大菌體使用量 ， 同時按比例增加 Buffer I、 Buffer II、 Buffer III 的用量 ，洗脫緩沖液應在 70℃預熱。可以適當的延長吸附和洗脫的時間 ，以增加提取效率。

3.得到的質粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260 值為 1 相當于大約 50μg/mL DNA。 電泳可能為單一條帶 ，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶 ，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。

本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。

4.質粒 DNA 確切分子大小 ， 必須酶切線性化后 ，對比 DNA 分子量 Marker 才可以知道。處于環狀或者超螺旋狀態的的質粒 ，泳動位置不確定 ，無法通過電泳知道其確切大小。

5.洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH 大于 7.5 ， pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫 ，質粒應該保存在－20℃ 。質粒 DNA 如果需要長期保存 ，可以用 TE 緩沖液洗脫（ 10mM Tris-HCl ， 1mM EDTA ，pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應 ，使用時可以適當稀釋。

使用方法

提示：

→第一次使用前請先在 Buffer PW 中加入 84 mL 無水乙醇 ，充分混勻 ，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇 ，以免多次加入!

→將 RNase A 加入 Buffer I 中 ，混勻 ，每次使用后置于 2-8℃保存。

1、取 100 ml-150ml（低拷貝 200 ml-250ml）過夜培養的菌液加入離心管 ， 8,000 rpm 離心3 min 收集細菌 ，棄上清。

2、加入 10 ml Buffer I（請先檢查是否已加入 RNase A） ，使用移液器或渦旋振蕩器懸浮沉淀。

3、加入 10 ml Buffer II ，立即溫和地上下翻轉 6-8 次（不要劇烈震蕩） ，使菌體充分裂解 ，室溫放置 5 min。

4、向離心管中加入 10 ml Buffer III，立即溫和地上下翻轉 6-8 次（溶液加完后應立即上下翻轉，以避免產生局部沉淀） ，充分混勻 ，至溶液出現白色、分散絮狀沉淀。室溫放置 10 min 后 ，再8,000 rpm 離心 10 min。

5、將步驟 4 的離心上清全部溶液轉移至內毒素吸附過濾柱中（請避免倒入大量沉淀 ，以免阻塞過濾器） ，緩慢推動推柄過濾 ，濾液收集在干凈的 50 mL 的管中。

6、 向濾液中加入 0.3 倍濾液體積的 Buffer PI ，0.1 倍濾液體積的 Buffer ER ，上下顛倒混勻后轉移到吸附柱中（吸附柱放入 50 ml 收集管中）。

注意： 吸附柱的最大容積為 20 ml ，所以需要分多次過柱。個別情況下離心機轉子傾角較大 ，此

時 ，建議加入吸附柱的溶液體積不超過 15 ml ，以防產生漏液現象。

7、 8,000 rpm 離心 2 min ，倒掉收集管中的廢液 ，將吸附柱重新放回收集管中。

8、 向吸附柱中加入 10mL 去蛋白液 Buffer PB ，8,000 rpm 離心 2 min。

9、 向吸附柱中加入 10 ml Buffer PW ，8,000 rpm 離心 2 min ，棄廢液 ，將吸附柱重新放回

收集管中。

10、重復操作步驟 9。

11、 向吸附柱中加入 3 ml Buffer PE ，室溫 8,000 rpm 離心 2 min ，棄廢液。

12、將吸附柱重新放回收集管中 ，8,000 rpm 離心 5 min ，以去除殘余的漂洗液。

13、打開吸附柱蓋子 ，置于室溫放置數分鐘 ，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

14、將吸附柱置于干凈的 50 ml 收集管中 ， 向吸附膜的中間部位懸空滴加 1-2 ml Buffer TE ，室溫放置 2 min ，然后 8,000 rpm 離心 2 min。將離心下來的質粒 DNA 全部移入到干凈的1.5 ml 離心管 ， -20℃保存。

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